Από τα πρώτα χρόνια της Ελληνικής Επανάστασης, έγιναν πολλές προσπάθειες για την ίδρυση τριτοβάθμιας εκπαίδευσης στο υπό ίδρυση Ελληνικό Κράτος. Κατά τη διάρκεια της διακυβέρνησης του Ιωάννη Καποδίστρια, οι προσπάθειες για την ίδρυση πανεπιστημίου σχεδόν εγκαταλείφθηκαν, καθώς ο Κυβερνήτης και το περιβάλλον του είχαν σχεδιάσει ένα εκπαιδευτικό πρόγραμμα που επικεντρωνόταν στην ανάπτυξη της πρωτοβάθμιας και τεχνικής εκπαίδευσης.
Με διαφορετική προσέγγιση, οι αντιβασιλείς του Όθωνα (1832-1862) συνέταξαν ένα πρόγραμμα για τη δημιουργία τριών διαδοχικών εκπαιδευτικών βαθμίδων, εμπνευσμένο από τα γερμανικά πρότυπα. Το 1836, κατά την απουσία του Όθωνα στη Βαυαρία, ο Ιωσήφ Λουδοβίκος φον Άρμανσπεργκ (1787-1853) εξέδωσε διάταγμα για τη σύσταση και τον κανονισμό λειτουργίας πανεπιστημίου. Παρόλα αυτά, η πράξη δεν επικυρώθηκε από τον βασιλιά.
Στις 24 Απριλίου 1837, δημοσιεύτηκαν τα νέα διατάγματα περί σύστασης πανεπιστημίου και προσωρινού κανονισμού λειτουργίας. Παρότι ο κανονισμός χαρακτηρίστηκε προσωρινός, παρέμεινε σε ισχύ για περίπου ογδόντα χρόνια, μέχρι το 1911, όταν ιδρύθηκε το δεύτερο Πανεπιστήμιο της χώρας, το Καποδιστριακό.
Σύμφωνα με το άρθρο 3 του διατάγματος, το Πανεπιστήμιον του Όθωνος απαρτιζόταν από τέσσερις Σχολές: της θεολογίας, των νομικών επιστημών, της ιατρικής και της φιλοσοφίας και εγκυκλίου παιδείας. Μεταξύ των τριάντα τεσσάρων καθηγητών που στελέχωναν το Πανεπιστήμιο, υπήρχαν σημαντικές προσωπικότητες της εποχής, όπως ο Νεόφυτος Δούκας (1760-1845), ο Γεώργιος Μαυροκορδάτος (1802-1858), ο Θεόκλητος Φαρμακίδης (1784-1860) και ο Ιωάννης Λεβαδεύς-Νικολαΐδης (1800-1871).
Στις 3 Μαΐου 1837, στην οικία του αρχιτέκτονα Σταμάτη Κλεάνθη (1802-1862), το Οθώνειο Πανεπιστήμιο άρχισε επίσημα τη λειτουργία του με πενήντα δύο φοιτητές και εβδομήντα δύο τακτικούς ακροατές. Από το 1837, παράλληλα με τη λειτουργία του στην οικία Κλεάνθη και Σάουμπερτ, ξεκίνησαν και οι εργασίες για την κατασκευή του Κεντρικού Κτηρίου, βάσει σχεδίων του Χανς Κρίστιαν Χάνσεν (1803-1883).
Τον Ιανουάριο του 1839, ο Πρύτανης Γεώργιος Α. Ράλλης συγκρότησε επιτροπή για τη συγκέντρωση δωρεών που θα επέτρεπαν την έναρξη των οικοδομικών εργασιών. Στην επιτροπή συμμετείχαν γνωστές φυσιογνωμίες του Αγώνα της Ανεξαρτησίας, όπως ο Θεόδωρος Κολοκοτρώνης, ο Γεώργιος Κουντουριώτης (1782-1858) και ο Νεόφυτος Βάμβας, των οποίων οι υπογραφές εμφανίζονται στην έκθεση του 1842.
Στις 2 Ιουλίου 1839, ο βασιλιάς Όθων έθεσε τον θεμέλιο λίθο του Πανεπιστημίου, σε επίσημη τελετή, και οι εργασίες ξεκίνησαν. Μέχρι το τέλος του 1840 είχε ολοκληρωθεί μόνο μία πτέρυγα του Πανεπιστημίου, αν και είχαν δαπανηθεί 160.000 δραχμές, ποσό που αρχικά θεωρούνταν επαρκές για την κατασκευή σχεδόν όλου του κτηρίου.
Τον Νοέμβριο του 1841, άρχισαν τα πρώτα μαθήματα στο Κεντρικό Κτήριο, παρόλο που οι εργασίες δεν είχαν ολοκληρωθεί. Η κύρια πτέρυγα (Προπύλαια) ολοκληρώθηκε το 1843, υπό την επίβλεψη του Εδουάρδου Σάουμπερτ, και το κτήριο ολοκληρώθηκε πλήρως το 1851.